植物病害生防細(xì)菌的篩選策略綜述隨著農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，瓜類和蔬菜保護地的重茬種植現(xiàn)象十分普遍，導(dǎo)致多種病害加劇發(fā)生，植物病害檢測儀進行病害檢測統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)以瓜類枯萎病、辣椒疫病等土傳病害尤為嚴(yán)重。由于此類病原菌存活于土壤之中，一般化學(xué)農(nóng)藥難以奏效，生產(chǎn)中頻繁使用高毒農(nóng)藥防治，從而加重了土壤農(nóng)藥的殘留。另外，由于長期的化學(xué)防治，目前病原菌對現(xiàn)有殺菌劑的抗藥性問題十分嚴(yán)重，對當(dāng)前農(nóng)業(yè)的發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。因此，出于環(huán)境保護和食品安全的需求，亟待開發(fā)新的、環(huán)境友好的微生物農(nóng)藥。

　　生物農(nóng)藥源于自然，環(huán)境相容性好，且具防效高、作用譜廣、對人畜低毒等特點，在病蟲害綜合治理中，是一類理想的可替代或部分替代化學(xué)農(nóng)藥的植保產(chǎn)品。大力發(fā)展生物農(nóng)藥及其相關(guān)產(chǎn)業(yè)符合當(dāng)前我國農(nóng)業(yè)和環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的要求，有利于促進我國農(nóng)業(yè)科技體制改革和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)型，從發(fā)展方向上屬于優(yōu)先支持和鼓勵發(fā)展的領(lǐng)域。而微生物農(nóng)藥因其資源豐富、可再生性強，易于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)，在生物農(nóng)藥中占有重要地位，代表著植物保護的方向，未來有望得到迅速發(fā)展，在環(huán)境保護和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮重要作用。生防微生物是微生物農(nóng)藥生產(chǎn)的源頭，一方面既可利用其活體直接用作農(nóng)藥，又可分離提取其活性代謝產(chǎn)物加工成一定的農(nóng)藥劑型;另一方面，農(nóng)藥的合成經(jīng)過幾十年的結(jié)構(gòu)篩選已幾乎遍及可想象的化學(xué)類型，化學(xué)農(nóng)藥的開發(fā)難度越來越大，成本越來越高，而微生物在進化過程中經(jīng)受環(huán)境壓力的多樣性和復(fù)雜性導(dǎo)致了其代謝產(chǎn)物的多樣性，為新穎獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)和新農(nóng)藥的創(chuàng)制提供了更多的機率，因而生防微生物資源的發(fā)掘利用也是開發(fā)創(chuàng)制新農(nóng)藥的重要途徑。

　　1生防菌的主要類群：植物病害生防微生物的主要類群包括真菌、細(xì)菌和放線菌。生防真菌研究較多的有木霉、粘帚霉、擬青霉等。已知的木霉9個主要種中有5個種具有生防潛力，至少對18個屬29種植物病原真菌有拮抗作用，當(dāng)前生產(chǎn)上利用多的是哈茨木霉，國外已有商品化的制劑問世，如美國的哈茨木霉T22和以色列的哈茨木霉。粘帚霉是習(xí)居于土壤的重寄生菌，對核盤菌、立枯絲核菌等植物土傳病原真菌及線蟲有很強的重寄生作用，且能產(chǎn)生次代謝產(chǎn)物，從粘帚霉中分離獲得的抗菌物質(zhì)已達50多個;近年來對其分離、鑒定、生物學(xué)特性、生防作用及其抗病機制的研究均有報道。擬青霉中著名的是淡紫擬青霉，為植物寄生線蟲的重要天敵，能夠有效防治根結(jié)線蟲和胞囊線蟲。生防細(xì)菌以繁殖速度快、易培養(yǎng)和在植株體內(nèi)定殖轉(zhuǎn)移等特點成為重要的生防資源。已有研究表明，至少有13個屬的細(xì)菌具有生防潛力，其中芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和土壤桿菌屬是目前研究的熱點。芽孢桿菌為土壤和植物微生態(tài)優(yōu)勢種群，抗逆性強，是一類理想的生防菌，應(yīng)用較多的是枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌等，國外已有商品化產(chǎn)品GB03、MBI600、QST713和FZB24等，可防治鐮刀菌等引起的根部病害;國內(nèi)已商品化的制劑有麥豐寧、亞寶、百抗、紋曲寧等，中國農(nóng)大開發(fā)的“增產(chǎn)菌”已在水稻、小麥等50多種植物上應(yīng)用。假單胞菌是典型的根際細(xì)菌，其生防機制主要為營養(yǎng)和病菌侵染位點的競爭，兼有拮抗作用，其中熒光假單胞菌、洋蔥假單胞菌、惡臭假單胞菌中的菌系用于馬鈴薯、胡蘿卜和小麥，增產(chǎn)效果分別達5%~33%，6%~14.4%和16.5%~28.1%;著名的植物根際促生細(xì)菌(PGPR)亦主要為熒光假單胞菌。放射土壤桿菌主要用于防治根癌病，澳大利亞分離的菌株可完全控制核果類果樹和玫瑰根癌病的發(fā)生，已在澳大利亞商品化;A.tumefaciens和A.vitis的無致病性菌株D286、HLB-2和F2/5、E26對不同的根癌病也有很好的抑制作用;中國農(nóng)大開發(fā)的放射土壤桿菌可濕性粉劑對核果類果樹根癌病防效達100%，已于2000年獲得注冊登記。放線菌是早發(fā)現(xiàn)的具有生防效果的微生物，其生防作用主要靠產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，在已發(fā)現(xiàn)的微生物活性產(chǎn)物中，約有2/3由放線菌產(chǎn)生，而鏈霉菌是重要的抗生素產(chǎn)生菌，生產(chǎn)上應(yīng)用的農(nóng)用抗生素約80%的活性成分均源于鏈霉菌，目前國內(nèi)對生防放線菌的利用也主要集中于抗生素，如井岡霉素全國推廣面積年約達870萬hm2，其它如農(nóng)抗120、多抗霉素、武夷菌素、中生菌素、寧南霉素等也已正式登記或臨時登記;放線菌的活體制劑已廣泛應(yīng)用的是Mycostop，主要用于防治腐霉菌、鐮刀菌、疫霉菌和絲核菌等引起的土傳病害;我國分離獲得的細(xì)黃鏈霉菌制成的“5406”抗生菌也有一定的推廣面積。

　　2生防菌的篩選策略：長期以來，微生物資源的開發(fā)利用以醫(yī)藥開發(fā)為主導(dǎo)，特別是對放線菌類所產(chǎn)生的醫(yī)用抗生素的研究較多。在分離和篩選方法上，20世紀(jì)60年代中期以前，由于有豐富的微生物資源可供研究，不需復(fù)雜的方法便能隨機篩選到目的菌株。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進步，開發(fā)新藥物的難度也大大增加，因此，許多新篩選方法應(yīng)運而生。報道較多的新藥篩選方法有靶標(biāo)定向篩選和高通量篩選，前者是將某種藥物或其特異基團作為靶標(biāo)進行定向檢測而建立各種不同的篩選程序，大大提高了新藥篩選效率;后者則由化合物庫、靶體選擇、靶體和化合物反應(yīng)的測試方法、靶體作用物的高通量篩選和數(shù)據(jù)的信息處理系統(tǒng)組成篩選平臺，針對各種藥物靶體從種類繁多的化合物中篩選佳的先導(dǎo)化合物，進而開發(fā)新藥物。此外，快速分子篩選方法也已得到應(yīng)用，美國Cyanamid公司運用獨特的分子篩選技術(shù)從世界各地采集的海洋微生物中尋找具有抗菌、抗病毒、抗癌等苗頭的藥物;我國徐平等依據(jù)放線菌基因組中大環(huán)聚酮類化合物生物合成途徑所用的I型PKS合成酶基因的存在與否標(biāo)定可能的大環(huán)聚酮類天然產(chǎn)物產(chǎn)生菌，建立了快速、簡便、的大環(huán)聚酮類化合物產(chǎn)生菌基因篩選體系。分子生物學(xué)和分子藥理學(xué)的研究闡明了許多生物大分子如酶、受體和離子通道等與病害之間的關(guān)系，這些生物大分子正逐步取代傳統(tǒng)的藥物篩選方法，發(fā)展成為藥物初篩的主要靶標(biāo)?！　≡谖⑸飾h(huán)境的選擇上，許多實驗室已轉(zhuǎn)向端環(huán)境微生物資源研究，包括嗜堿、嗜鹽、嗜酸、端高低溫、高壓、輻射等特殊環(huán)境微生物以及植物內(nèi)生菌，近年海洋微生物資源也成了新的研究熱點。在藥源微生物的類群上，特別是在放線菌中，鏈霉菌以外的稀有放線菌被認(rèn)為是新藥的重要來源。

　　據(jù)估計，每克土壤中微生物數(shù)量高達4000種，而采用現(xiàn)有技術(shù)能夠培養(yǎng)的僅為微生物總數(shù)的1%~10%，多達90%~99%的不可培養(yǎng)微生物正在成為開拓新資源的目標(biāo);基于此，Handesman等提出了一個全新的理念———“宏基因組克隆”，直接提取環(huán)境中所有微生物的基因組DNA，克隆到合適的載體，構(gòu)建宏基因組文庫，再運用序列篩選或功能篩選方式從文庫中獲得酶、抗生素等生物活性物質(zhì)及相關(guān)基因。該研究策略克服了多數(shù)土壤微生物無法分離培養(yǎng)的難題，增加了獲得新生物活性物質(zhì)的機會，已得到成功的應(yīng)用。迄今人類所認(rèn)知的真菌約7萬多種，細(xì)菌5000多種，放線菌3000多種，而實際利用的可能還不到0.1%，再加上90%~99%未知的種類，可見對自然界微生物資源的研究和開發(fā)仍有十分廣闊的空間。

　　3目前研究中存在的問題與對策：植物病害生防微生物菌種的評價和篩選傳統(tǒng)上注重其生物活性的考察，一般以作物病害沒有發(fā)生、病害減少或不能發(fā)展的土壤為主要來源，經(jīng)室內(nèi)離體生測、溫室植株接種和田間防效實驗，終篩選出可在生產(chǎn)上應(yīng)用的生防菌。

　　此過程歷時長，工作量大，且室內(nèi)篩選和田間應(yīng)用的效果往往不一致，造成菌株的漏選。更重要的是，如上所述，經(jīng)過多年的活性篩選，傳統(tǒng)的方法在常規(guī)的生態(tài)環(huán)境中已很難獲得具有新活性或產(chǎn)生新物質(zhì)的菌株，所以往往是已知活性菌株的重復(fù)性試驗和小范圍內(nèi)的應(yīng)用，缺少創(chuàng)新性的突破，也就很難形成規(guī)模化生產(chǎn)。近年對一些與抗病作用機制有關(guān)的基因或酶類等生物大分子的檢測技術(shù)也逐漸應(yīng)用到生防菌的篩選和評價研究中，如通過PCR技術(shù)檢測鐮刀霉素合成基因fusA、β-1,3-葡聚糖酶基因、表面活性肽合成基因、幾丁質(zhì)酶基因，通過生化的方法檢測木霉生防菌株中幾丁質(zhì)酶的活力等。但總的看，生防微生物資源的研究較醫(yī)藥微生物資源相對落后，因此，借鑒醫(yī)藥源微生物資源開發(fā)的新技術(shù)，優(yōu)選生防微生物發(fā)掘的生態(tài)環(huán)境，擴大篩選范圍和信息的獲取量，加強生防微生物新穎性的科學(xué)評價，在此基礎(chǔ)上建立新的菌株篩選體系，以增加新菌株發(fā)現(xiàn)的機率，是微生物新農(nóng)藥創(chuàng)制中亟待加強的重要基礎(chǔ)科學(xué)問題。

　　我國微生物資源豐富，發(fā)展微生物農(nóng)藥的條件得天獨厚。而如何從豐富的微生物資源中分離篩選創(chuàng)新性菌株是成功創(chuàng)制微生物新農(nóng)藥、開發(fā)自主知識產(chǎn)權(quán)的新產(chǎn)品的先決條件。目前我國生物農(nóng)藥占市場份額僅為1.7%左右，遠(yuǎn)低于世界平均水平，與發(fā)達相比尚有較大差距，存在的突出問題主要是：仿制國外產(chǎn)品多，原創(chuàng)性拳頭產(chǎn)品少。究其原因，對生防微生物資源的創(chuàng)新性研究不夠，雖然篩選獲得了許多具有抗病活性的目標(biāo)生物，但缺乏能夠用于生產(chǎn)新農(nóng)藥的菌株是關(guān)鍵性瓶頸之一。因此，在未來研究中，研究者需利用現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)的生物學(xué)方法有機結(jié)合，搭建生防微生物資源創(chuàng)新研究平臺，發(fā)掘新的生防微生物資源，力爭在新的關(guān)鍵生防因子的發(fā)現(xiàn)和利用方面有所突破。